育才学习网1.T载体如何制备
用限制性内切酶制备T载体 陆哲明，柯 杨△[北京大学临床肿瘤学院（北京市肿瘤防治研究所）遗传室，北京 100034] [关键词]T载体；DNA限制酶类；遗传载体；基因扩增[摘 要] 目的：介绍一种制备T载体的方法。
方法：用限制性内切酶XcmⅠ酶切，在两端产生T末端，制备的T载体可直接用来克隆用TaqDNA聚合酶产生带A末端的PCR产物。结果：PCR产物直接和T载体连接，用常规氯化钙法制备的感受态菌转化，对转化子提取质粒进行酶切鉴定，证明阳性率达80%。
结论：制备T载体过程简单，质量稳定，产量高，并可扩增等优点。[中图分类号]Q342 [文献标识码]A [文章编号]1671 167X(2002)06 0726 03 PCR是目前体外DNA扩增最常用的方法，对PCR产物进行快速有效的克隆是开展下游许多实验所要求的。
目前TA克隆是一种快速的，一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的方法。而商品化的TA克隆系统由于售价高，质量批次间不稳定且无法进行循环使用等缺点，在实际应用中，限制了T载体的广泛使用。
本文介绍了一种简单、高效，可在普通实验室中制备并可反复扩增的T载体制备方法，并经PCR产物克隆，酶切鉴定，得到了非常理想的结果。1 材料与方法1.1 制备SuperpGEM Teasy载体（简称pSP Teasy载体）1.1.1 制备pSP Teasy环化载体 以线性化的pGEM Teasy载体（Promega为模板，两边设计引物：F: HindⅢ XcmⅠG AATTCGCG R: HindⅢ XcmⅠC CGCGGCCGCCA 引物的5′端各插入HindⅢ和XcmⅠ位点，3′端与模板互补，在PfuDNA聚合酶的作用下扩增，扩增产物经HindⅢ酶切后，自身环化，挑选能被HindⅢ酶切的克隆即为阳性克隆，经测序进一步证实。
1.1.2 制备pSP Teasy线性化载体 按照标准酶切体系，用XcmⅠ（NEB）酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，玻璃奶回收，测量吸光度值（D260），调整质量浓度至50mg·L-1，此载体可直接用于克隆。3 讨论PCR技术是目前体外扩增DNA最常用的方法。
有时需得到克隆化的DNA以便于杂交分析、高质量测序及从复杂PCR产物中分离目的片段。常用的方法有非定向克隆和定向克隆。
定向克隆需在引物5′端引入限制性内切酶位点，PCR产物经适当内切酶酶切后产生粘端，连接到相应载体。非定向克隆有两种策略，一种是平末端克隆，在klenow和T4DNA聚合酶作用下修平PCR产物末端，但连接效率仅为粘端连接的1/50，且自身环化率高[1]；另一种是TA克隆。
TA克隆是一种快速的，一步到位的非定向克隆法，可以把PCR产物直接插入到质粒载体。TA克隆系统利用TaqDNA聚合酶的末端转移酶活性，在扩增DNA3′末端非模板依赖地加上一个核苷酸，通常为腺苷酸[2]。
这个3′A突出端被用于把PCR产物插入到插入位点有一个3′T突出端的载体。制备好的载体，其关键部分是带有3′T突出端的线性分子。
目前制备3′T载体的方法是先用平末端限制性内切酶（如EcoRⅤ）酶切载体，再用TaqDNA聚合酶在仅有dTTP的情况下，72~75℃反应，在3′末端添加一个T[1,3]。但是，实际反应过程中，由于3′末端加T为非优先聚合核苷酸，仅部分的3′端可添加T，或者有少量可能添加一个以上T，造成载体在克隆过程中自身环化高，必然增加筛选阳性克隆的难度。
另外，每次生产T载体产量有限（一般为1μg），不适于大规模生产，造成批次间质量差异大。即使商品化TA克隆试剂盒也存在阳性率低和质量不稳定的缺点。
因其价格昂贵，并且无法进行循环使用，在普及上存在一定困难。利用限制性内切酶制备T载体利用限制性内切酶特异性强，一次酶切产量高，质量稳定，易于操作等特点。
在内切酶家族中，有一类称可变酶，它们的识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的，如本文采用的XcmⅠ，它识别序列见图3a，在构建pSP Teasy载体时，利用其中间序列可变，在靠近T7启动子端，设计了XcmⅠ的识别序列见图3b，而在靠近SP6启动子端XcmⅠ的识别序列见图3c，这样在XcmⅠ酶切后，其剩余的序列如图1，在3′端分别产生T。经查NewEnglandBiolabs公司的目录，符合上述特征的酶列于表1。
我们在两个XcmⅠ之间引入HindⅢ位点有下列优点：（1）在构建pSP Teasy时提供方便；（2）经HindⅢ酶切后，可以防止载体中的XcmⅠ位点不完全酶切造成的自身环化；（3）两个XcmⅠ位点之间，提供保护的碱基，便于XcmⅠ酶切。用于克隆的PCR产物在连接前需经琼脂糖凝胶电泳，如条带锐利，则一般无需纯化即可直接用于连接；如产物有非特异扩增或引物二聚体浓度较高，最好先用低熔点胶或玻璃奶法纯化。
如果扩增用具有保真功能的聚合酶，如PfuDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶或TliDNA聚合酶，由于它们有3′~5′的外切酶活性，则PCR产物为平末端，需经纯化后用TaqDNA聚合酶在dATP存在下72℃加腺苷酸尾15~30min，即可达到相同效果。插入片段（PCR产物）与载体摩尔比一般要求在3∶1~1∶3之间，但按笔者经验，摩尔比不经优化亦可产生较好克隆效果，可能与pSP 。
2.什么是T载体
T载体又称T-vector。聚合酶链反应产物的克隆运载体，线性化后两侧3′端各多出一个脱氧胸苷酸（T）。由于PCR产物两侧3′端通常含单个脱氧腺苷酸（A），与T载体之间的A-T互补性可提高PCR产物克隆的效率。
T载体是一种克隆载体，也就是用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体，它不能大量表达。多用于克隆PCR产物，一般用一些常见的载体改造成的，一般的DNA聚合酶没有3'-5'核酸外切酶活性，即酶的校正活性，在PCR产物3'末端以非模板依靠方式加上一个腺苷酸残基（A），这样PCR产物的3'腺苷酸可和T-载体的3'胸腺嘧啶 互补，T-载体系统进行有效连接的基础正是这种碱基配对作用。相反，有校正活性的聚合酶将移去这个3' 突出端，产生平端PCR产物，这种产物不能直接用T-载体系统进行克隆。
假如想要一PCR扩增基因的产物大量表达，常见的方法是先将PCR产物连入T载体扩增（所用T载体需事先设计好酶切位点），再用相应酶切下目的片段，然后连入以同样酶切处理后的表达载体大量表达蛋白质。